Phương pháp nhuộm Gram

Năm 1884, nhà vi sinh vật học Đan Mạch đưa ra phương pháp nhuộm Gram để phân biệt vi khuẩn Gram dương (+) và vi khuẩn Gram âm (-). Phương pháp nhuộm Gram gồm các bước:

• Cố định tiêu bản rồi nhuộm bằng thuốc nhuộm kiềm (tím kết tinh) trong 1 phút. Rửa nước loại bỏ thuốc nhuộm thừa.
• Xử lí bằng dịch Lugol (iốt) trong 1 phút để iốt tạo phức với tím kết tinh làm bền màu, sau đó rửa bằng nước.
• Làm mất màu bằng alcol hoặc axetôn (1 phút). Lúc này vi khuẩn Gram âm (-) là không màu, vi khuẩn Gram dương (+) có màu tím.
• Để dễ quan sát, cần nhuộm thêm thuốc nhuộm axit (fushin) có màu đỏ. Kết quả: Vi khuẩn Gram dương (+) có màu tím; Vi khuẩn Gram âm (-) có màu đỏ.

Màng tế bào vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglican dày hơn ở vi khuẩn Gram âm nên khả năng giữ màu trong phương pháp nhuộm Gram.

Lưu ý rằng, bản thân peptidoglica không bị nhuộm màu, nhưng ngăn cản sự thất thoát của tím kết tinh. Khi tẩy bằng cồn, ở vi khuẩn Gram dương, các lỗ peptidoglican dày lại, có nhiều liên kết chéo, nên giữ được màu, trong khi ở vi khuẩn Gram âm, lớp peptidoglican mỏng, các lỗ lớn. Khi tẩy bằng dung môi đã làm tan lipit, nên kích thước lỗ càng lớn hơn khiến càng dễ thoát màu ra khỏi tế bào.